孙 萱, 杨 云, 耿信笃3
(西北大学现代分离科学研究所,现代分离科学省级重点实验室,教育部合成与
天然功能分子化学重点实验室,陕西西安710069)
摘 要:选取了四种常用的弱阳离子交换(WCX) 商品柱以研究标准蛋白在其上的色谱保留行为。发现在疏水色谱( HIC) 模式下,蛋白在这四种WCX 商品柱上也有不同程度的保留特征,且洗脱曲线呈现出保留值随盐浓度变化的“U”型。从分子力学角度定性解释了因疏水相互作用力的存在影响了蛋白在WCX 色谱柱上洗脱顺序的改变。运用计量置换理论(SDT) 中的两组线性方程进一步证实了WCX 和HIC 中蛋白与固定相间相互作用力的性质,在HIC 中为非选择性作用力,而在离子交换色谱( IEC) 中为选择性作用力。这四种色谱柱中的两种事实上可在WCX 和HIC 两种模式下,对标准蛋白进行分离且有较好的分离效果,有可能作为二维色谱柱来使用。
关键词:离子交换色谱;疏水色谱;计量置换;混合保留机理;蛋白分离
中图分类号:O657. 7+ 5 文献标识码:A 文章编号:100626144(2010) 0120006205
由于用离子交换色谱( IEC) 分离后所得的蛋白能保持较高的活性,且不用昂贵和有毒的有机溶剂作流动相,在蛋白质科学和蛋白药物领域中有着广泛的应用。为提高蛋白的质量回收率, IEC 的固定相表面应具有尽可能高的亲水性,以消除因疏水性对蛋白产生的非特异性吸附。然而众所周知,在过去一个世纪以来所设计的一切色谱介质都只是溶质以一种力与其固定相的相互作用的一维色谱,一般不能满足蛋白纯化中纯度大于95 %的要求,故常常要用二维液相色谱(2D2LC) 及多维液相色谱( mD2LC) 模式进行蛋白分离[ 124 ] 。
Kennedy 等[ 5 ] 和Melander等[ 6 ] 分别发现了阴离子交换色谱(AEX) 具有疏水色谱( HIC) 的性质, 并称其为混合机理。卫引茂等[ 7 ] 也发现了HIC 柱同时具有IEC 机理, 统称为混合保留机理。他们均绘出了能表达蛋白双保留机理特征的“U”型洗脱曲线图。柯从玉等[8 ] 用一种特殊的色谱固定相同时具有HIC和弱阳离子交换(WCX) 两种好的色谱分离功能,从而用一根色谱柱和不同的流动相就能实现通常要用两根WCX 和HIC 色谱柱单独使用的蛋白分离效果,称该色谱柱为二维色谱柱(2D column) ,在此基础上又提出了在线单柱二维液相色谱法(On2line Two2dimensional Liquid Chromatography by a Single Column ,On2line 2D2LC21C) 以实现天然蛋白的快速分离[9 ] 。
为大大加快天然蛋白的纯化速度,本文使用了四种适用范围较广,且具有代表性的WCX 商品柱以探索其是否能成为2D 色谱柱的可能性。为此,研究了它们在WCX 和HIC 模式下对蛋白的相互作用及分离特征。发现蛋白在这四种WCX 柱中均存在有HIC 保留机理,表明了WCX 中存在疏水作用是一个普遍存在的现象,对蛋白分离存在着有利和不利两方面的影响。
1 实验部分
1. 1 主要仪器与试剂
LC220A 高效液相色谱仪(日本,岛津公司) ,包括两台LC220A T 泵, 一台SPD220A 紫外可见检测器,Rheodyne 7725 i 手动进样阀和N2000 色谱工作站; PB210 型p H 计(德国,SartoriusA G) ; KQ2250 型超声仪(上海昆山检测仪器厂) ;CascadaL S 型纯水仪( PallCo. Ltd ,美国) 。细胞色素c (Cyt c ,马心肌) 、核糖核酸酶A ( RNase A ,牛胰脏) 、肌红蛋白(Myo , 马心肌) 、溶菌酶(Lys , 鸡蛋清) 、α2糜蛋白酶(α2Chy , 牛胰脏) 、胰岛素( Ins , 牛胰脏) 、α2淀粉酶(α2Amy) 均购自Sigma 公司。
1. 2 色谱条件
色谱柱Ⅰ: TSKgel CM25PW column (75 ×7. 5 mm i. d. ) ;色谱柱Ⅱ:Shim2pack WCX21 column (50 ×4. 0 mm i. d. ) ;色谱柱Ⅲ:Shim2pack WCX PA2CM(100 ×8. 0 mm i. d. ) ;色谱柱Ⅳ: PolyCA T ATM (150 ×4. 6 mm i. d. ) 。
WCX 流动相A 液: 0. 050 mol/ L KH2 PO4 (p H = 6. 5) ; B 液: 1. 0 mol/ L NaCl + 0. 050 mol/ LKH2 PO4 (p H = 6. 5) ;线性梯度:B 液0 %～100 % 30 min 。HIC 流动相A 液: 3. 0 mol/ L (N H4 ) 2 SO4 +0. 050 mol/ L KH2 PO4 (p H = 6. 5) ;流动相B 液:0. 050 mol/ L KH2 PO4 (p H = 6. 5) ;线性梯度:柱Ⅰ、Ⅱ、ⅣB 液0 %～100 % ,柱ⅢB 液17 %～100 % 30 min 。流速1. 0 mL/ min ;检测波长为280 nm ;柱温:室温。
1. 3 流动相中[ H2O] 的计算