SDS-聚丙烯酰胺电泳法。其中，SDS-聚丙烯酰胺电泳法操作简单、应用广泛，但对实验空间要求高、样品需要量大、采用的试剂对环境不友好。另外3种方法因测试精度不高或仪器过于昂贵，应用范围受到限制。毛细管电泳技术凭借高效、快速、样品需用量少、分离模式多样的优势，在蛋白质、核酸等生命分析中发挥着重要的作用。毛细管胶束电动色谱法（Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）通过在运行缓冲液中加入离子型表面活性剂形成胶束，被分离物质在水相和胶束相之间发生分配且随电渗流在毛细管内迁移而达到分离。本法依据不同种类蛋白质质荷比的不同，在运行缓冲溶液中加入阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS），利用MEKC法对蛋白质进行分离，方法准确、样品需要量少，在针对较为珍贵样品的分子量测定方面具有较强的优势；同时，高灵敏度检测器有利于低含量蛋白质的测定。[1-2]

 

 

1 实验部分

1.1 实验试剂和材料

SDS-MW分析试剂盒配有样品缓冲溶液、分离缓冲溶液和10、20、35、50、100、150和225 kDa 标准分子量蛋白质混合溶液（16 mg/mL）购自Beckman公司；大麦虫、黄粉虫和白兴花金龟三种昆虫均为实验室养殖；其他试剂均为市售分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

1.2  毛细管电泳条件

Beckman PA 800 plus型毛细管电泳仪配有二极管阵列检测器，未涂层毛细管总长度48.5 cm，有效长度40 cm，内径50 μm (Beckman，美国)。电压进样5 kV，进样时间20 s，分离温度25℃，检测波长220 nm；分离电压15 kV，分离时间30 min。

1.3 样品制备

将养殖好的昆虫按照表1所示进行处理。取1#样品0.8 g放入10 mL水，匀浆2 min，3000 rpm离心10 min，取上清，得到蛋白质提取物。分别取2#-5#样品0.1 g溶解于20 mL水中，震荡2 min，超声提取20 min，5℃静置，分层后取上清，得到蛋白质提取物。利用10 kD截留分子量的超滤管分别将蛋白质提取溶液过滤，浓缩10倍，按照SDS-MW分析试剂盒配所述方法处理后进行上机测试。

表1 昆虫样品处理方法

 

 

2 结果与讨论

2.1 迁移时间-分子量标准曲线

采用MEKC分离模式时，其运行缓冲溶液中会使用的SDS浓度高于其临界胶束浓度（CMC）值，运行缓冲溶液的粘度较大，因此冲洗时候需要采用高于70 psi的压力以使溶液进入毛细管。选用10 kD蛋白质为参照标准，当其迁移时间不变时，视为分离条件稳定。在此条件下已知分子量的标准蛋白质可以得到基线分离，电泳峰按照分子量由小到大依次排列，如图1所示。

图1. 7种标准分子量蛋白质的电泳图

电泳条件：未涂层毛细管40/48.5 cm（有效长度/总长），内径50 μm，电压进样5 kV，进样时间20 s，分离温度25℃，分离电压15 kV，分离时间30 min，检测波长220 nm。

 

标准蛋白质超过5个时，应以迁移时间为横坐标，分子量对其作图（表2），采用Logarithamic法计算得到迁移时间-分子量标准曲线，如图2所示。

 

表2 标准曲线

图2. 迁移时间-分子量标准曲线

Beckman LogarithamicPA 800 plus工作站中带有Logarithamic法计算功能

 

2.2 提取方法的影响

蛋白质的结构决定了它在水中的溶解性，提取过程则可以根据蛋白质的性质不同，将其进行选择性收集。如大麦虫活虫冷冻后直接进行蛋白质测定，则只能得到10~20 kD、20 ~100 kD分子量范围内的蛋白质各1种（表3-1#）；经冻干并80℃压榨提油后，可以得到10~20 kD、20 ~100 kD分子量范围内的蛋白质各3种，大于100 kD分子量的蛋白质1种（表3-2#）；经过提取，蛋白质数量得到明显增加，且提取到的蛋白质种类也有所不同。因此，提取过程对蛋白质的信息的表征有重要的作用。

 

图3. 大麦虫提取物电泳图（a：不经过提取； b: 80℃压榨提取）

 

不同提取方法的提取效果不同。黄粉虫采用80℃压榨提油法提取仅能得到10~20 kD分子量范围内的蛋白质2种，而采用超临界提取后可以得到10~20 kD分子量范围内的蛋白质3种（表3-3#），10~20 kD分子量范围内的蛋白质1种（表3-4#）。以上结果表明，相同的提取方法对不同种类昆虫中蛋白质的提取效果是不同的，需要根据实验室的需要选择提取方法。

2.3 昆虫种类的影响

不同种类的昆虫含有的蛋白质种类不同。均采用80℃压榨提油法提取，大麦虫、黄粉虫和白兴花金龟3中昆虫的蛋白质数量也不相同（表4）。其中，大麦虫的蛋白质种类最多，分子量分布最广；分子量大于100kD的蛋白质的含量比较高，或者水溶性比较好，是其他两种昆虫不具备的。黄粉虫的蛋白质分子量不超过30kD,白兴花金龟只能得到10~20 kD分子量范围内的蛋白质3种，说明这种虫体重高分子量蛋白质的含量极低，或者此方法不适合提此种虫子中的高分子量蛋白质。

图4. 黄粉虫提取物电泳图（a：80℃压榨提取； b: 超临界提取）

 

 

3. 结论

蛋白质的富集、检测与提取方法有很大关系，利用毛细管凝胶电泳法可以准确测定蛋白质的分子量，进而判定蛋白质种类，为蛋白质的选择收集或者去除提供了重要的实验依据。本方法在蛋白质、多肽及相关产品的研发、生产、检测过程中均有广泛的应用前景。

 

参考文献：

[1] SDS蛋白质无胶筛分毛细管电泳测定γ干扰素的分子量. 薛俊,汪正范,1995,第二届全国毛细管电泳学术报告会.

[2] 田义, 张新忠, 张志宏, 丛佩华, 康国栋. 无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变蛋白质变化规律中的应用. 植物学通报, 2008,25(5):586-590.