摘要:分子式 黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性,其毒性作用主要是对肝脏的损害。
1.适用范围本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素B1含量的检验。
2.原理概要样品用三氯甲烷提取,提取液经硅胶柱净化,净化后的提取液用三氟乙酸衍生,用配有荧光检测器的液相色谱仪测定,外标法定量。
3. 主要试剂和仪器3.1.主要试剂三氯甲烷;正己烷;苯;甲醇:紫外光谱级;乙腈:紫外光谱级;三氟乙酸;乙腈-水溶液(1+1);三氯甲烷-甲醇溶液 (95+5);苯-乙腈溶液(98+2);黄曲霉毒素B1标准品:纯度≥99%;黄曲霉毒素B1标准溶液:准确称取适量的黄曲霉毒素B1标准品,以苯-乙 腈溶液于棕色容量瓶中,配成浓度为10μg/mL标准贮备液。根据需要,再配成适当浓度的标准工作溶液。
3.2.仪器液相色 谱仪,配有荧光检测器;硅胶小柱:WatersSep-pakSilica前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱;振荡器;旋转蒸发器,配有100mL具尾管 的圆底烧瓶;微量注射器;离心管:5mL具塞磨口;粉碎机;滤膜:有机系用,0.45μm;微孔滤膜过滤器:有机系用,0.5μm。
4.试样的抽取与制备4.1.检验批以不超过2000件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征,如包装、标记、产地、规格、等级等。
4.2. 抽样数量批量,件最低抽样数,件1~516~50251~50011501~1000161001~1500191501~2000204.3.抽样方法 从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取2.2规定的件数,逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上,用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约500g。将所 取样品充分混匀,用四分法或分样器逐步缩分出500g,装入洁净密封的样品筒内,加封后,标明标记,及时送实验室。
4.4.试样制备将所取回样品全部磨碎,通过20目筛,混匀,均分成两份试样,装入洁净容器内,密封,标明标记。
4.5.试样保存将试样于室温下保存。
注:在抽样和制样的操作过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
5. 过程简述5.1.提取称取试样5.0g(精确到0.1g)置于100mL具塞锥形烧瓶中,加入15mL三氯甲烷,于振荡器上提取30min,然后经垫有玻 璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内,并用三氯甲烷洗涤滤渣,收集滤液至约20mL。
5.2.净化用 旋转蒸发器将上述滤液在50℃水浴中浓缩至约1mL,经0.45μm滤膜过滤后,注入硅胶小柱中。用2~4mL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱,弃去流出液。然 后用3~4mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒钟2滴的流速洗脱,收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干,供衍生用。
5.3.衍生 5.3.1.试样加200μL正己烷和50μL三氟乙酸于上述离心管中,盖紧磨口塞,超声振荡1min,静置10min,打开磨口塞,缓缓通入氮气至干。 用乙腈-水溶液(1+1)定容至1.0mL,超声1min,用0.5μm滤膜过滤,滤液供液相色谱用。
5.3.2.标准工作溶液取1.0mL标准工作溶液,用氮气缓缓吹干,按5.3.1步骤操作。
5.4.测定5.4.1.色谱条件色谱柱:NOVAPAKc18,300mm×3.9mm(内径);流动相:甲醇-水溶液(42+58);流速:0.8mL/min;荧光检测器:激发波长375nm,发射波长425nm;色谱柱温度:室温。
5.4.2. 测定根据样液中黄曲霉毒素B1的含量情况,选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对 标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下,黄曲霉毒素B1衍生物保留时间约为8min。
5.4.3.空白试验除不加试样外,按上述测定步骤进行。
6. 结果计算用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素B1的含量:X=A·csAs·c式中:X——试样中黄曲霉毒素B1的含量,mg/kg;A——样 液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰面积,mm2;cs——标准工作溶液中黄曲霉毒素B1的浓度,μg/mL;As——标准工作溶液中黄曲霉毒素B1衍生物的峰 面积,mm2;c——最终样液所代表试样的浓度,g/mL。
注:计算结果需扣除空白值。
7.低限和回收率测定7.1.低限本方法的测定低限为0.001mg/kg。
7.2.回收率回收率的实验数据:黄曲霉毒素B1的添加浓度在0.001~0.5mg/kg范围内,回收率为89.1%~104.9%。