高效液相色谱法同时测定鸭梨种子中3种内源激素

高效液相色谱法同时测定鸭梨种子中3种内源激素
【摘要】建立了高效液相色谱同时测定鸭梨种子中3种内源激素赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)含量的方法。采用C18反相色谱柱，柱温35℃，以甲醇水(含1%乙酸)(4∶6，V/V)为流动相，流速为1mL/min，检测器波长开始用254nm，2.5min时将波长切换至210nm，至3.8min，GA3出峰结束后，再次将波长切换回254nm测定IAA和ABA。GA3、IAA和ABA的平均回收率分别为92.8%、91.6%和94.7%。为快速、准确分离和测定鸭梨种子内源激素提供了一种可靠方法。
　　
【关键词】高效液相色谱;内源激素;鸭梨;种子
　　
　　1引言
　　
　　果实的生长成熟是一个复杂的生理生化过程，植物激素与果实的发育及成熟程度有关，而种子又是激素合成的主要场所[1]，因此，掌握内源激素在种子中的变化规律，对研究水果在采摘后的生理、成熟、衰老及褐变过程具有重要意义[2]。
　　
　　植物激素在植物体内含量甚微，而且其在植物体内的组成复杂，相互共存的干扰组分多，对温度等条件敏感，因而对植物激素的测定比较困难[3]。高效液相色谱(HPLC)是较理想的植物内源激素分析方法，植物激素的HPLC测定已在仁用杏花芽[4]、甜樱桃[5]、梨[6]等果实，油菜[7]、莴苣[8]等籽粒上有所应用，对植物种子方面，主要集中在银杏[9]、山楂[10]、甜樱桃[5]、五味子[11]、早蜜梨和黄金梨[6]等种子的激素含量测定上，而对鸭梨种子中激素的分离、测定还未见。由于在联合测定植物组织抽提液中的多种内源激素时，经常出现分离差、峰型不良及严重拖尾现象，因此选择合适的内源激素提取方法和色谱条件尤为重要[12]。本研究采用高效液相色谱法对鸭梨种子中的赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)3种植物激素进行联合分离与测定，建立起灵敏、简便、快速测定植物种子激素的方法。
　　
　　2实验部分
　　
　　2.1仪器、试剂与材料
　　
　　1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括1200四元梯度泵、1200VWD检测器、HPLC2D工作站;KQ3200E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器厂);RE2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);GA3、IAA和ABA标样(纯度≥99%，Sigma公司);PVPP(Sigma公司);甲醇(色谱纯，德国Merck公司);乙酸、乙酸乙酯和石油醚(分析纯，天津大学科威公司);实验用水为超纯水。实验所选材料为北京市密云县不老屯镇燕落村的套袋鸭梨，于2008年9月16日采摘，于12℃预冷24h后，放入(0±1)℃冷库中贮藏。贮藏期间每隔一定时间随机选取40个，挑出种子进行测定。
　　
　　2.2标准品的制备
　　
　　分别准确称取0.01gGA3、IAA和ABA标样，用流动相溶解定容至100mL棕色容量瓶中，作为母液(100mg/L)，用以流动相、波长、柱温的选择和定性分析。以流动相为溶剂，分别配制100mg/LGA3、10mg/LIAA和2.5mg/LABA的工作液。
　　
　　2.3样品的制备
　　
　　样品前处理方法参照文献[13～15]，并加以改进。称取鸭梨种子1.0g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80%甲醇溶液10mL(内含10μg/L的抗氧化剂BHT)，放置4℃冰箱中过夜，浸提液以13000r/min离心15min得上清液，残渣按1∶8和1∶4(w/V)分别加入80%甲醇8和4mL，重复浸提两次，合并3次所得的上清液，全部滤液于35℃减压浓缩至原体积1/3，再用1mol/LNa2HPO4调节至pH=8.0，加入等体积石油醚萃取脱色3～5次，弃去酯相后，加入0.1g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)吸附酚类物质，常温下摇床振荡30min，过滤弃去PVPP，滤液用2mo1/L柠檬酸调节至pH=3，再用等体积乙酸乙酯萃取3～5次，合并酯相，于35℃减压浓缩至干，所得残留物加入3mLpH3.5磷酸盐缓冲液溶解，过SepPakC18预处理小柱，进一步纯化GA3、IAA和ABA，用80%甲醇洗脱收集后，在40～43℃浓缩至干，用流动相溶解残渣并定容至2mL，溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
　　
　　2.4HPLC条件
　　
　　AgilentC18ZORBAX反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm);柱温：35℃;流动相为V(甲醇)∶V(水，含1%乙酸)=4∶6;流速：1.0mL/min;进样量：20μL;采用切换波长法;以外标法进行定量测定。
　　
　　3结果与讨论
　　
　　3.1色谱条件的筛选
　　
　　3.1.1流动相的选择
　　
　　流动相筛选实验发现，以V(甲醇)∶V(水)=5∶5为流动相，GA3，IAA和ABA色谱峰拖尾严重，有平头峰，分离效果不理想(图1a)，加入适量乙酸可使三者分离效果得到改善，乙酸浓度对保留值和灵敏度影响不大，实验最后选择了含有1%乙酸的水溶液，既能保证3种激素完全分离，又能避免酸度太大造成色谱柱填料的损害。选用不同的比例的甲醇水作为流动相，对3种内源激素混合标样进行分离，实验发现，以V(甲醇)∶V(水)=7∶3为流动相，3种激素色谱峰均不能分开，Rs≤0.3;以V(甲醇)∶V(水)=3∶7为流动相，灵敏度太低;以V(甲醇)∶V(水)=6∶4或5∶5为流动相，GA3和IAA的色谱峰不能彻底分离;而以V(甲醇)∶V(水)=4∶6为流动相，3种激素的色谱峰的峰型尖锐，分离度高，重复性好(图1b)。本研究以甲醇水(含1%乙酸)(4∶6，V/V)为流动相。
　　
　　3.1.2波长的选择
　　
　　将100mg/L混合标准母液稀释10倍，分别在200～300nm范围内进行光谱扫描，发现GA3，IAA和ABA的最大吸收波长分别为210，250和265nm。参考文献[4]的条件，在254nm波长下同时测定3种激素，并对样品进行了测定(图2)，GA3响应值较低。采用HPLC法分析多组分物质时常采用单一波长，但单波长检测不能使待测组分的响应值达到最大，切变波长可减少一些溶剂物质的干扰，更利于待测组分的分析检测[16,17]，所以本实验采用切换波长法检测植物内源激素。首先选择254nm为检测波长，使溶剂峰较小化;在2.5min时GA3将要出峰，将检测器波长切换到GA3的最大吸收波长210nm，3.8min出峰结束，再次将波长切换到254nm处，对IAA和ABA进行检测(图3)。虽然在254nm下IAA和ABA的吸收值未达到最大，但已接近于最大，并且可以避免多次切换波长造成的基线漂移。
　　
　　3.1.3柱温和流速的选择
　　
　　柱温对分析时间影响较明显，柱温为20℃时，分离一个样品需25min;柱温升为35℃时，分离一个样品只需15min，因此选择柱温为35℃。随着流速的增加，各组分保留时间均缩短，但重叠现象也加剧;而流速太小则会延长测定时间，经过筛选确定最佳流速为1mL/min。
　　
　　3.2内源激素的定性分析
　　
　　用上述优化的色谱条件，对3种激素标准品进行分析(图4)。由图4可知，GA3，IAA和ABA的保留时间分别为(2.928±0.072)min、(5.532±0.089)min和(11.956±0.054)min。
　　
　　3.3内源激素的定量分析
　　
　　由图2可见，GA3在254nm下响应值较低。采用切换波长法(图3)，可明显提高GA3的检测灵敏度，且3种组份均得到了良好分离。GA3，IAA和ABA在样品色谱图中的保留时间分别为2.916，5.525和11.962min，与标准品色谱图中保留时间基本一致，说明本实验采用的样品分离和HPLC色谱条件可以满足鸭梨种子中3种激素的同时测定的要求。
　　
　　以3种激素的混合标准溶液为原液，分别稀释数倍，配制成含有GA3、IAA和ABA的系列标准溶液;在优化的色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(x)，计算得到各个内源激素的回归方程、线性范围和相关系数(表1)。由表1可见，3种激素标准品的浓度与峰面积相关性良好，相关系数均大于0.99。表1激素在色谱条件下的标准曲线(略)
　　
　　3.4回收率的测定和实际样品分析
　　
　　称取1.0g鸭梨种子，按照2.3中方法制备样品并按照上述方法进行测定，在已测样品中加入精确称重的相当于样品0.5，1.0，2.0倍的标准样品，测定激素含量，计算加标回收率，结果如表2所示。GA3，IAA和ABA的平均回收率为92.8%，91.6%和94.7%，相对标准偏差均小于6.7%，说明本方法符合定量分析要求，数据误差小，上述提取及色谱条件是可行的。
　　
　　利用本方法对鸭梨种子内源激素含量进行了测定，并对贮藏中含量变化进行了跟踪。结果表明：鸭梨贮藏过程中，种子内的GA3和IAA含量呈先降后升，再降再升的变化趋势，GA3含量最高为349μg/g，最低为163μg/g;IAA含量最高为9.13μg/g，最低为2.45μg/g。ABA含量呈逐渐下降的趋势，初始值为1.58μg/g，贮藏末期降至0.36μg/g。本方法能够满足对鸭梨贮藏中种子激素变化的检测要求，为进一步研究鸭梨种子激素代谢与果实褐变的关系奠定了基础。表2激素的加标回收率(略)

通讯员：羽轩转载