活性氧（ROS）参与许多退行性神经系统病症，如阿兹海默症、帕金森症、萎缩性脊髓侧索硬化以及年老或外伤导致的脑功能紊乱等。此外活性氧是植物体内正常代谢的信号小分子，在植物的生长发育和抗逆反应中具有重要作用。目前各领域中常见的四种ROS的检测分析方法有：化学发发光法、荧光探针法、分光光度法、电子顺磁共振法。


CheKine? 活性氧（ROS）检测试剂盒（KTB1910）提供了一种简单、灵敏、快速的ROS检测方法，其原理是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA（二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯）可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的酯酶水解，形成DCFH，DCFH无荧光且不能通透细胞膜，其可以被细胞内的活性氧（ROS）氧化生成有荧光的DCF，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测和观察活细胞内DCF的荧光信号强度，即可以分析细胞活性氧的水平。



CheKine? 活性氧（ROS）检测试剂盒的操作步骤如下：



对于刺激时间较短（通常为2 h以内）的细胞，建议先装载探针，后用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞；对于需要较长时间刺激（通常为6 h以上）的细胞，建议先用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。



1.原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞)

2.收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞)

3.荧光显微拍照

4.流式细胞分析操作方法



注意事项：



1.阳性对照H2O2一般使用浓度为100 μM （推荐浓度50-200 μM，具体依细胞类型而定） 。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果荧光信号过强，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。

2.实验过程中，如果阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000 稀释荧光探针DCFH-DA，使DCFH-DA的终浓度为 2-5 μM。探针装载的时间可在15-60 min 内适当进行调整，尽量缩短读片时的曝光时间，并且试验组、对照组曝光时间需保持一致。

活性氧阳性对照 (H2O2) 仅仅用于作为阳性对照的样品，并非所有试验组样品中都需加入活性氧阳性对照。

3.探针装载后，一定要洗净未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

4.尽量缩短探针装载后到检测所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。



文章来源：http://www.abbkine.cn/reactive-oxygen-species-ros-detection